"СОВРЕМЕННАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА" №3 2019 г.

Скачать издание (pdf)

Листать издание (pdf-вьювер)

Информация для рекламодателей (pdf)

САЙТ МЕДРЕЕСТР - УДОБНЫЙ ПОИСК МЕДТЕХНИКИ И ТОРГУЮЩИХ ФИРМ


Современные возможности культурального метода выявления протеев

Шепелин А. П., Полосенко О. В., ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Оболенск, Россия

Микроорганизмы группы Proteus spp, в частности вид Proteus vulgaris, в небольшом количестве встречается как в кишечнике человека и животного, так и во внешней среде. Он является возбудителем гнилостных процессов в природе. Вид Proteus mirabilis – обитатель кишечника человека и животных.

Микроорганизмы pода Proteus относятся к факультативным обитателям толстого кишечника человека и обнаруживаются лишь у 5-10% здоровых людей, поэтому самостоятельного значения как показатель фекального загрязнения не имеют, но имеют определенное санитарно-показательное значение. Обнаружение большого количества P. vulgaris в почве, воде свидетельствует о содержании в них и разрушении органических веществ животного происхождения. При загрязнении объектов внешней среды фекальными стоками, как правило, выявляют P. mirabilis [1].

Как санитарно-показательные микроорганизмы бактерии рода Proteus вместе с бактериями группы кишечной палочки, энтерококками, сульфитредуцирующими клостридиями, колифагами применяют для санитарно-гигиенической оценки почвы, воды открытых водоемов [2].

Существуют гигиенические нормативы по микробиологическим показателям безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов, которые включают несколько групп микроорганизмов, в том числе условно-патогенные, в том числе и бактерии рода Proteus [6, 9].

Бактериологический метод – основной и наиболее достоверный метод диагностики протейной инфекции. Диагноз инфекции, вызванной Proteus spp., зависит от результатов культурального выделения микроорганизма.

Микроб хорошо культивируется на обычных питательных средах. При посеве материала, содержащего бактерии рода Proteus, в конденсационную воду свежескошенного агара (метод Шукевича) через несколько часов на мясо-пептонном агаре отмечается роение микроба, “ползучий” нежный вуалеобразный рост [4].

Посев по методу Шукевича широко применяют в диагностических лабораториях при выделении протея из объектов внешней среды и продуктов.

Идентификация энтеробактерий начинается с изучения их колоний на дифференциально-диагностических средах. Для целей клинической микробиологии это, в первую очередь, среды Эндо или агар с эозин-метиленовым синим. При исследовании кишечного содержимого могут быть использованы дополнительно среды Плоскирева, висмут-сульфитный агар и др. На среде Эндо P. vulgaris и P. mirabilis обычно дают вуалеобразный рост (роение) (Рис. 1). Нероящиеся представители рода протеев обычно образуют более “нежные” колонии небольших размеров [5, 7, 10].

При выделении чистых культур с плотных питательных сред возникают затруднения из-за феномена роения, поэтому используют селективные питательные среды. ФБУН ГНЦ ПМБ производит ряд селективных питательных сред, на которых возможно наблюдать рост протея без роения.

Питательная среда для выделения сальмонелл и шигелл (SS-агар) обеспечивает рост тест-штаммов P. mirabilis 3177 и P. vulgaris HX 19 222 через 18-20 ч. инкубации при температуре (37±1)°С при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6. Рост тест-штамма P. mirabilis 3177 сопровождается образованием колоний бурого цвета с темным центром диаметром 2,0-4,0 мм без роения. (Рис. 2а) рост P. vulgaris HX 19 222 – в виде бесцветных колоний диаметром 2,0-4,0 мм, возможно частичное очаговое роение (Рис. 2b).

Питательная среда для селективного выделения и учета всех видов энтеробактерий (агар Мосселя) обеспечивает визуально обнаруживаемый рост P. mirabilis 3177 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси тест-штамма из разведения 10-6 через 20-24 ч. инкубации при температуре (37±1)°С в виде круглых, малинового цвета колоний, с зоной преципитации, диаметром 1,5-2,5 мм [8] (Рис. 3).

Высокоселективная питательная среда для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий (XLD-агар) обладает хорошими дифференцирующими свойствами. Бактерии, продуцирующие в процессе роста на XLD-агаре сероводород, образуют колонии с черным центром. Образование черного центра происходит в процессе химической реакции солей железа, входящих в состав среды, с сероводородом и образованием в результате реакции сульфида железа черного цвета. Поэтому среда обеспечивает рост сероводородобразующего тест-штамма P. mirabilis 3177 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6 через 20-24 ч. инкубации при температуре (37±1)°С в виде круглых, прозрачных колоний с черным центром, диаметром 1,0-2,5 мм (Рис. 4).

Новая питательная среда “Дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения протеев” производства ФБУН ГНЦ ПМБ на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) обеспечивает рост всех видов протеев и четкую внутривидовую дифференциацию через 24 ч. культивирования без роения в виде светло-желтых или бесцветных колоний диаметром 2-3 мм с черным центром. Желчные кислоты и полимиксина В сульфат подавляют рост микробов – ассоциантов [3].

Дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения протеев с селективной добавкой при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6 через 20-24 ч. инкубации при температуре (37±1)°С обеспечивает рост тест-штаммов Providencia alcalifaciens NCTC 1068-50, Proteus mirabilis 3177, Proteus vulgaris HX 19 222 в виде:

• колонии P. alcalifaciens NCTC 1068-50 – круглые, гладкие, полупрозрачные, розового цвета диаметром от 1,5 до 2,5 мм (Рис. 5a);

• колонии P. mirabilis 3177 – круглые, гладкие, полупрозрачные, розовые с темным центром, диаметром от 1,0 до 2,5 мм (Рис. 5b);

• колонии P. vulgaris HX 19 222 – круглые, гладкие, полупрозрачные, желтоватые со слабым пожелтением среды, возможно образование темного центра, диаметром от 1,0 до 2,5 мм.

Некоторыми зарубежными компаниями вы-пускается CLED Agar – Среда для культивиро-вания бактерий из мочевых путей, которая обеспечивает дифференциацию выделенных штаммов по признаку ферментации лактозы. Среда является неселективной и обеспечивает рост не только протеев, но и Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli. Штаммы, не ферментирующие лактозу, образуют синие колонии. Микроорганизмы, ферментирующие лактозу, понижают уровень рН и изменяют цвет среды с зеленого на желтый.

Среда CLED Agar не обеспечивает внутривидовую дифференциацию протеев, поскольку рост тест-штаммов P. alcalifaciens NCTC 1068-50 и P. mirabilis 3177 на среде идентичен – в виде синих колоний (Рис. 6а и 6b).

Опорными тестами для идентификации бактерии рода Proteus являются: дезаминирование фенилаланина, реакция на сероводород, реакция с метилротом, реакция Фогес-Проскауэра, разжижение желатина.

Важнейший признак протеев, отличающий их от прочих энтеробактерий, – способность дезаминировать фенилаланин. Питательная среда для дифференциации энтеробактерий по тесту дезаминирования фенилаланина (Фенилаланин-агар) используется для дифференциации Proteus spp., Providencia spp. и Morganella spp. от других энтеробактерий по признаку дезаминирования фенилаланина до фенилпировиноградной кислоты. Культуры микроорганизмов, дезаминирующие фенилаланин, после внесения треххлористого железа изменяют цвет поверхности среды и конденсата на дне пробирки со светло-желтого на зеленый; не дезаминирующие фенилаланин – не изменяют цвета среды и конденсата. (Рис. 7а, 7b).

Таким образом, использование селективных и эффективных отечественных питательных сред для выделения протеев позволит усовершенствовать методы микробиологического анализа, использовать меньший набор питательных сред при проведении исследований и улучшить качество микробиологических исследований.

Список литературы:

1. Кондакова Г. В. Санитарная микробиология. / Г. В. Кондакова. – Ярославль: ЯрГУ, 2005. – 84 с.

2. Литусов Н. В., Сергеев А. Г., Григорьева Ю. В., Ишутинова В. Г. Микрофлора окружающей среды и тела человека: учебное пособие. – Екатеринбург, 2008. – 28 с.

3. Мартовецкий М. Н. Разработка питательных сред для выделения протеев и клебсиелл. / М. Н. Мартовецкий, А. П. Шепелин, И. И. Марчихина, Л. П. Шолохова, О. В. Полосенко // Инфекция и иммунитет. 2106 – № 3 (6) – С. 66.

4. Методика. Индикации бактерий рода “Протеус” в кормах животного происхождения. 1981 г. (Дата актуализации 01.01.2019), утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР.

5. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений: Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 г., № 535 – М., 1985. – 126 с.

6. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов СанПиН 2.3.2.1078-01 (с изменениями на 6 июля 2011 г.).

7. Шепелин А. П., Дятлов И. А. / Питательные среды для энтеробактерий. Монография. – М.: Изд. Династия, 2017. – 232 с.

8. Шепелин А. П. Клинические испытания агара и бульона Мосселя. / А. П. Шепелин, И. И. Марчихина, О. В. Полосенко, Л. П. Шолохова, Н. И. Ажермачева, О. Н. Доброхотский, Т. Х. Борзенкова //Клиническая лабораторная диагностика. 2017 – № 10 (62). – С. 631-635.

9. Шепелин А. П. Микробиологический контроль качества пищевой продукции. / А. П. Шепелин, И. А. Дятлов, О. В. Полосенко // Бактериология. 2017 – № 2 (2). – С. 39–47.

10. Шепелин А. П. Клинические испытания питательных сред для накопления сальмонелл. /

А. П. Шепелин, О. В. Полосенко, И. И. Марчихина, Л. П. Шолохова, Н. И. Ажермачева, М. Г. Ершова, Е. Д. Полетаева // Клиническая лабораторная диагностика. 2018 – № 9 (63). – С. 557-563.

ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора

Федеральное бюджетное учреждение науки “Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии” Роспотребнадзора

142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск • Тел.: +7 (4967) 36-00-03, +7 (4967) 36-00-10

e-mail: info@obolensk.org • www.obolensk.org, www.sredy-obolensk.ru