СКАЧАТЬ (15.0 Кб в архиве, формат - MS Word)

"Лабораторная диагностика" №3 2011 г.

ПРИ ПУБЛИКАЦИИ МАТЕРИАЛОВ ССЫЛКА НА ИСТОЧНИК ОБЯЗАТЕЛЬНА !!!

ПОДПИСКА НА ЖУРНАЛ

САЙТ МЕДРЕЕСТР - УДОБНЫЙ ПОИСК МЕДТЕХНИКИ И ТОРГУЮЩИХ ФИРМ


ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Лапин С.В. к.м.н.

Лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова

Тел. (812) 499-71-94, E-mail: autoimmun@mail.ru, Сайт: www.autoimmun.ru

Аутоиммунные заболевания: определение и эпидемиология

Иммунный ответ, направленный против антигенов нормальной человеческой ткани и органов называют аутоиммунным. Аутоиммунный ответ является основой патогенеза большого числа аутоиммунных заболеваний (АИЗ) и аутоиммунных реакций. Среди болезней человека насчитывают около 100 нозологических форм с аутоиммунным патогенезом, в то время как число аутоиммунных реакций и синдромов может достигать нескольких сотен. Кроме того, для целого ряда заболеваний, таких как шизофрения, эндометриоз или боковой амиотрофический склероз, патогенез которых окончательно не ясен, существуют теории аутоиммунного генеза, которые основаны на ряде фактических доказательств, в том числе выявлении аутоантител. Очевидно, что аутоиммунный ответ является естественным компонентом иммунной системы. Его разнообразные проявления можно найти в развитии многих инфекционных, метаболических, онкологических заболеваний, а также иммунодефицитных состояниях, процессах, связанных с ростом организма и его старением.

Хотя термин “аутоиммунное заболевание” или “аутоиммунная реакция” используется в литературе уже несколько десятилетий, однако, в связи с разнообразием иммунных механизмов и нозологических проявлений, однозначного медицинского понимания этого термина не существует. В связи с этим в большинстве академических определений патогенеза ревматологических заболеваний отсутствует понятие “аутоиммунное”, вместо которого используется термин “иммуно-воспалительное” или просто “воспалительное”. Действительно, при ряде АИЗ, таких как ревматоидный артрит или системные васкулиты, иммунное воспаление выражено чрезвычайно ярко. Однако при ряде классических аутоиммунных заболеваний, например сахарном диабете 1 типа, признаки воспаления как таковые отсутствуют.

В связи с этим, для классификации аутоиммунных процессов используются медико-биологические критерии (Rose, Bona, 1993). Этот набор критериев сложно использовать в клинической практике, так как для их понимания требуется большой объем научных данных, которые основаны преимущественно на животных и клеточных моделях. В то же время аутоиммунные заболевания (АИЗ) обладают рядом четких клинических характеристик, к которым, прежде всего, относятся следующие:

1. Процессы неизвестной этиологии с хроническим системным/тканевым воспалением.

2. Возникновение у лиц с особым набором генов иммунного ответа (в частности генов системы HLA).

3. Большинство заболеваний поддаются терапии иммуносупрессивными препаратами.

4. Наличие в крови и биологических жидкостях аутореактивных клеток и аутоантител.

Этиологическая причина аутоиммунных процессов в большинстве случаев не ясна. В то же время, АИЗ могут быть индуцированы инфекциями, курением, опухолью, гормональным дисбалансом, недостатком витаминов, компонентами пищи и рядом других причин. К настоящему времени причинно-следственный путь от возможного этиологического фактора до полного понимания патогенеза сталкивается с ограниченным пониманием всех механизмов иммунной системы. Аутоиммунные реакции иногда сложно отличить от аллергических реакций, так как в их развитии принимают участие основные иммунные механизмы. Строго говоря, аллергические реакции запускаются и поддерживаются присутствием причинного экзогенного аллергена. При аутоиммунных реакциях обычно действие внешнего фактора может запускать аутоагрессивный иммунный ответ и не требуется для дальнейшего развития и поддержания АИЗ.

Генетический фон играет важную, но не определяющую роль в развитии АИЗ. Для множества частых аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз или диабет, около 10% пациентов имеют кровного родственника также больного АИЗ. Предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям и их наследование обусловлены особенностями генетики иммунной системы. Одними из основных генетических маркеров АИЗ являются гены системы основного комплекса гистосовместимости человека (или HLA), которые отвечают за распознавание внешних и внут-ренних антигенов. Так как гены системы HLA определяют направление иммунного ответа, определенный набор генов приводит к ответу против собственных аутоантигенов организма. Генотипирование системы HLA используется для диагностики многих АИЗ, в частности серонегативных артропатий и целиакии. Генотипирование других генов до настоящего времени имеет ограниченное значение в практической диагностике основных аутоиммунных заболеваний.

Для контроля иммуновоспалительных и аутоиммунных реакций широко используются иммуносупрессивные и иммуномодулирующие препараты. В большинстве случаев успешная терапия воспалительного заболевания с помощью таких препаратов является прямым подтверждением аутоиммунного патогенеза заболевания.

Аутореактивные клетки могут быть обнаружены в крови и тканях больных с аутоиммунными заболеваниями. Большинство иммуносупрессивных препаратов, которые используются для терапии АИЗ, направлены на подавление функций именно аутореактивных иммунных клеток. Несмотря на большую роль клеточного иммунитета в патогенезе аутоиммунных заболеваний, возможности лабораторных методов оценки специфичности клеточных ответов очень ограничены. Поэтому исследовать аутоиммунные клеточные ответы у пациентов для диагностических целей при современном развитии иммунологии все еще невозможно.

Аутоантитела, направленные против собственных молекул организма, также играют большую роль в патогенезе аутоиммунных реакций. В то же время аутоантитела зачастую не связаны с непосредственным повреждением ткани при АИЗ и являются лишь “свидетелями” аутоиммунных реакций. Благодаря большому набору надежных серологических методов обнаружение аутоантител позволяет широко использовать их для практической лабораторной диагностики АИЗ. По аналогии с инфекционными процессами, где серодиагностика играет одну из ведущих ролей, серодиагностика аутоиммунных процессов является важным инструментом в выявлении и последующем ведении пациентов. Серологические методы часто используются в клинико-лабораторных критериях как основной метод объективизации диагноза. Особое значение приобретает их выявление на ранних этапах заболевания, когда морфологические проявления разрушения ткани еще отсутствуют.

Аутоантитела как основные диагностические показатели

Целый ряд особенностей отличает методы обнаружения аутоантител от оценки содержания других биологических молекул в биологических жидкостях, поэтому ряд аспектов диагностического использования аутоантител требует отдельного освещения.

Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgA, IgM, специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого организма. Появление аутоантител представляет собой нормальный биологический феномен, а связывание иммуноглобулинов с собственными антигенами можно выявить в сыворотке любого человека. В норме существует охарактеризованная популяция CD5+ В-клеток, синтезирующая полиреактивные низкоаффинные иммуноглобулины, способные связываться со многими антигенами. Роль аутоантител в норме и причина их появления изучена недостаточно. Вероятно, что причиной образования аутоантител является перекрестная реактивность иммуногенных эпитопов между антигенами инфекционных агентов и собственными молекулами организма. Спектр антигенных стимулов, окружающих человека, постоянно меняется, что ведет к образованию низкоаффинных непатогенных аутоантител.

Аутоантитела отмечаются при инфекционных и онкологических заболеваниях, воспалительных процессах различного генеза, хронических интоксикациях (алкоголизме), либо на фоне приема лекарственных препаратов. Появление ревматоидного фактора при инфекции вирусным гепатитом С, антимиокардиальных антител при вирусных миокардитах указывает на большое значение инфекции в генезе аутоиммунных процессов. Встречаемость антинуклеарных антител несколько возрастает у пациентов с онкологическими заболеваниями, причем индукция антинуклеарных антител на фоне опухоли может указывать на лучший прогноз у онкологических больных. Встречаемость ряда аутоантител, в частности ревматоидного и антинуклеарного фактора, нарастает в пожилом возрасте. Однако титры аутоантител, присутствующих в норме, низки и при сравнительно нестойки с течением времени.

Возможность использования конкретной разновидности аутоантител в качестве диагностического показателя определяется их встречаемостью при АИЗ. Встречаемость тех аутоантител, которые используются для клинической диагностики, обычно составляет более 60-70% при патологии, менее 1% в норме и других заболеваниях. Хорошие клинико-лабораторные параметры многих разновидностей аутоантител позволяют рассматривать их в качестве лабораторных маркеров этих заболеваний, то есть высокоспецифичных лабораторных тестов, обладающих исключительной диагностической информативностью. Высокоспецифичными серологическими маркерам называют те разновидности аутоантител, которые встречаются исключительно при этом заболевании. Так, к высокоспецифичным серологическим маркерам относят антитела к двуспиральной ДНК при СКВ или антицитруллиновые антитела при ревматоидном артрите. Некоторые аутоантитела могут одновременно быть высокоспецифичными маркерами нескольких групп заболеваний. Например, антитела к цитоплазме нейтрофилов отмечаются как при гранулематозных васкулитах, так и воспалительных заболеваниях кишечника.

Обычно появление высоких титров специфических аутоантител у клинически здоровых лиц может рассматриваться в качестве фактора риска развития аутоиммунного заболевания. Аутоантитела в сыворотке крови могут обнаруживаться за несколько месяцев до клинических проявлений заболевания. Так при ревматоидном артрите антицитруллиновые антитела могут быть обнаружены за несколько лет до дебюта артрита, обнаружение антинейтрофильных антител предваряет развитие гломерулонефрита на несколько месяцев.

Клиническое значение обнаружения аутоантител отчасти зависит от титров содержания аутоантител в сыворотке обследуемого. Обычно высокое содержание антител указывает на высокую аффинность последних. Это, в свою очередь, характеризует специфичность и выраженность иммунного ответа. Обнаружение высоких титров антител обычно указывает на аутоиммунное заболевание, в то время как низкие титры часто отмечаются в норме и не специфичны. В отсутствии иммуносупрессивного лечения при аутоиммунных заболеваниях содержание аутоантител обычно сохраняется высоким длительное время. В случае появления антител на фоне инфекции или неиммунного воспаления титры антител обычно нестойки и подвержены значительным колебаниям. Аутоантитела могут быть индуцированы воспалительным, инфекционным, онкологическим процессом или спровоцированы назначением определенных препаратов. Для того чтобы отличить транзиторную индукцию аутоантител от хронического присутствия аутоантител при АИЗ, может потребоваться повторное обследование. Учитывая, что время полужизни сывороточного иммуноглобулина IgG составляет около трех недель, минимальное время между повторными обследованиями должно превышать 1-3 месяца. В то же время продукция аутоантител при АИЗ не является постоянной величиной. Встречаемость аутоантител может нарастать с увеличением длительности АИЗ, как это происходит при ревматоидном артрите, или опускаться ниже порога детекции в течение первого года заболевания при сахарном диабете.

Хотя большинство аутоантител являются свидетелями аутоиммунного воспаления, и их содержание не коррелирует с активностью заболевания, обнаружение определенных типов аутоантител при ревматических заболеваниях указывает на характерные особенности клинического течения. Так, у пациентов, имеющих в сыворотке специфический набор антител, наблюдается особенное течение заболевания, отличное от симптоматики больных, не имеющих этих антител. При СКВ, сопровождающейся антителами к рибонуклеопротеиновым антигенам, гломерулонефрит встречается значительно реже, чем у больных, имеющих высокий титр антител к двуспиральной ДНК, но имеется определенный риск развития поражений кожи и наклонность к повышенной фоточувствительности. Поэтому определение АНА позволяет врачу предсказать, а иногда и предотвратить развитие специфических осложнений. Динамика титра определенных видов антител в ходе заболевания имеет прогностическое значение. Увеличение концентрации антител к дсДНК предшествует вспышке СКВ, и ранняя патогенетическая терапия может уберечь больного от развития клинических проявлений или уменьшить их остроту, что улучшает прогноз при этом заболевании.

Выделение больных с тем или иным типом аутоантител в отдельную, часто клинически гомогенную группу подтверждается обнаружением определенного HLA генотипа у больных с конкретным типом АНА. Так, например, пациенты с ревматоидным артритом с антицитруллиновыми антителами обычно несут особую последовательность аминокислот в составе антигена HLADRB1 и имеют высокий риск развития деструкций суставов. Таким образом, исследование содержания аутоантител и их спектра указывают на особенности функционирования иммунной системы и отражают ее особую предрасположенность к формированию аутоиммунных ответов.

Методические подходы к выявлению аутоантител в лаборатории

Учитывая разнообразние антигенов, аутоантитела для удобства группируют в семейства, реагирующие с мишенями одного рода. Например, все представители семейства антинуклеарных антител реагируют с рибонуклеопротеиновыми антигенами ядер; аутоантитела, относящиеся к семейству антинейтрофильных цитоплазматических антител, реагируют с набором антигенов, локализованных в гранулах цитоплазмы нейтрофилов. Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному антигену, представляет собой поликлональную популяцию антител, представленную молекулами иммуноглобулинов с разными физико-химическими свойствами. Это обусловлено тем, что поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверхности молекулы-антигена, причем сила связи каждой молекулы антитела с антигеном (аффинность) различна. Естественно, что в идеале иммунологический лабораторный метод должен выявлять не одну разновидность молекул, как это происходит в большинстве традиционных лабораторных тестов, а целый спектр аутоантител, направленных на разные антигены, причем каждое антитело значительно отличается от других по заряду, молекулярной массе и силе связывания с антигеном, которая зависит от условий реакции. Такого идеального метода не существует.

На практике для точного описания спектра аутоантител, присутствующих в биологической жидкости, используется несколько методов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В результате интерпертация результатов исследования одного лабораторного показателя зависит от метода, с помощью он определен.

Еще одной особенностью практического выявления аутоантител, вытекающей из биологической природы этого феномена, является то, что не существует абсолютно корректного подхода к измерению содержания аутоантител. Дело в том, что большинство иммунологических тестов построены на связывании аутоантитела и антигена-мишени. Результат теста зависит как от физической концентрации аутоантител, так и аффинности аутоантитела и антигена. При аутоиммунных заболеваниях специфические антитела синтезируются в высокой концетрации и обычно обладают большой аффинностью. Однако большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать сигнал более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических аутоантител. Так, у больных с СКВ, у которых в результате поликлональной активации В-клеток синтезируется большое количество полиспецифичных антител, наблюдаются ложно-положительные реакции в серологических тестах для обнаружения антител к вирусу гепатита С. В то же время, при волчаночном нефрите с нефротическим синдромом, в результате неселективной протеинурии утрачивается сывороточный IgG. В результате при низком содержании IgG тесты по выявлению аутоантител могут быть ложно-отрицательны.

В практической диагностике огромное значение имеет метод непрямой иммунофлюоресценции. С его помощью можно обнаружить связывание антител с тканевым или клеточным субстратом, содержащим максимально широкий спектр аутоантигенов. Этот метод быстр и удобен, не требует дорогостоящего оборудования, но он субъективен и плохо поддается автоматизации. Однако по мнению авторитетных советов экспертов, непрямая иммунофлюоресценция на сегодняшний день незаменима для обнаружения таких семейств аутоантител, как антинуклеарные антитела, антитела к цитоплазме нейтрофилов, антитела при аутоиммунных заболеваниях печени и ряда других серологических маркеров.

В отличие от него, более популярный метод иммуноферментного анализа (ИФА) более удобен для автоматизации и стандартизации. Однако при использовании ИФА в области аутоиммунной диагностики необходимо помнить о ряде особенностей этого метода. Метод ИФА целесообразно использовать при обнаружении аутоантител только к одному хорошо охарактеризованному аутоантигену. В ходе предварительного синтеза и очистки аутоантигена утрачиваются многие конформационные эпитопы, что несомнено снижает чувствительность обследования. При внесении в лунку планшета смеси антигенов неизбежно возникает конкуренция между антигенами за связывание с пластиком, кроме того, за счет связи антигенов между собой могут образовываться неоантигены, которые снижают специфичность обследования. Отчасти эти ограничения можно преодолеть с использованием иммуноблота (или лайн-блота), сравнительно недавно появившихся на рынке тест-систем, основанных на рекомбинантных антигенах, нанесенных на мембранную подложку. Пространственное разделение очищенных белков, их небольшое количество, используемое в тест-системах, позволяет проводить выявление многих специ-фичностей аутоантител в одной реакции. Одним из передовых методов серологического обследования является мультиплексный анализ, при котором аутоантигены сорбированы на поверхности микросфер, а связывание аутоантител регистрируется с помощью проточной цитометрии. К сожалению, высокая стоимость оборудования и реактивов ограничивает широкое использование этого метода в практических лаборатория нашей страны.

Одним из принципиальных компонентов организации любого лабораторного обследования является организация вопросов внешней оценки качества. С 2006 года в рамках Федеральной системы внешней оценки качества лабораторных исследований (ФС-ВОК) в сотрудничестве с Санкт-Петербургским региональным отделением Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов были организованы две первые программы аутоиммунной серологии, направленные на контроль правильности определения ревматоидного фактора и антинуклеарных антител. С тех пор перечень показателей аутоиммунной серологии был значительно расширен и к 2011 году насчитывает 8 специализированных программ, которые включают в себя определение более 30 отдельных показателей.

Принципы обследования пациентов с аутоиммунными заболеваниями

Планирование серологического обследования зависит от клинической задачи, которую требуется решить клиницисту. В свою очередь, назначение конкретных тестов зависит от их клинико-лабораторных параметров. Несмотря на определенные трудности в интерпретации результатов иммунологического обследования, а также большой объем информации, который необходимо принимать во внимание при анализе результатов обследования, информативность иммунологических тестов очень высока. Особенности постановки диагностической задачи и планировании иммунологического обследования приведены в таблице:

Задача обследования

Используемый метод

Скрининг аутоантител при ранней диагностике

Непрямая иммунофлюоресценция

Дифференциальная диагностика

Иммуноблот и мультиплексный анализ

Мониторинг эффективности терапии

Иммуноферментный анализ, иммунохимические методы

Для скрининга используются тесты, отрицательный результат которых с большой вероятностью позволяет исключить заболевание, т.е. тесты с высокой чувствительностью. Обычно такими параметрами обладают методы, которые позволяют одновременно выявлять антитела к антигенам одного семейства. Так, отрицательный результат выявления АНФ делает диагноз СКВ или системной склеродермии маловероятным.

Часто уже на этапе скрининга необходимо назначать комбинации тестов, параллельное использование которых значительно снижает вероятность ошибочного исключения диагноза. Так, в диагностике ревматоидного артрита, учитывая низкие клинико-диагностические параметры выявление ревматоидного фактора в дебюте этого заболевания, рационально назначать панель тестов, включающую как ревматоидный фактор, так и антицитруллиновые антитела.

Дифференциальная диагностика требует назначения тестов, обладающих большей специфичностью. Так при обнаружении низких титров АНФ, выявление антител к дсДНК, указывает на диагноз СКВ. В той же ситуации обнаружение высокого содержания РФ или антител к цитруллиновым антигенам указывает на ревматоидный артрит. Не менее важен воп-рос о результатах тестов, которые находятся в “серой зоне”. В случае скринингового теста результат, находящийся в “серой зоне”, следует интерпретировать как неспецифический, в то время как у пациента с уже определенным диагнозом тот же результат следует отнести к низкой, но значимой концентрации аутоантител. При решении задач дифференциальной диагностики комбинации тестов делают результат обследования более убедительным. Так диагностика антифосфолипидного синдрома с помощью антифосфолипидных антител должна расширяться за счет параллельного обследования для диагностики СКВ.

Хотя литературных данных, указывающих на необходимость широкого скрининга аутоантител в клинике немного, однако, существуют исследования, свидетельствующие, что расширение спектра назначений значительно увеличивает число диагностических находок при аутоиммунных заболеваниях. Среди аутоантител, которые позволили диагностировать аутоиммунное заболевание, лидируют антинуклеарные антитела, которые встречаются при многих аутоиммунных заболеваниях. По нашему собственному опыту, комбинированное тестирование, несомненно, улучшает информативность обследования пациентов. Комбинированное тестирование, включающее параллельный скрининг разных аутоиммунных заболеваний, имеющих общие черты, крайне информативно при дифференциальной диагностике “системных” ревматических заболеваний. Такой подход позволяет рекомендовать наборы тестов и комплексные алгоритмы обследования, что, в итоге, приводит к росту числа диагностических находок.